达为科生物E15天胎鼠脊髓神经元的原代培养

一、背景

      神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分组织，如大脑皮层、海马、脊髓等脑组织直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多，但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些亟待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

     神经细胞的体外培养技术是研究神经源性疾病的发病机制、进程的一个重要工具，能很好的、直观的反映离体神经元的发育状况和生理活性，如何建立一个稳定成熟的神经细胞培养体系是神经系统疾病体外实验研究顺利进行的基础。随着基础医学及临床医学研究的逐渐深入，神经细胞的体外培养技术在脑损伤、神经障碍性疾病、衰老相关神经疾病方面得到广泛重视和普及应用。

二、实验步骤

(1)75%酒精消毒孕鼠，在无菌条件下取出胎鼠，分离并切取脊髓，置于冷的无钙、镁的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)；

(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管；

(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小，0.05%胰酶37℃消化15-20min，每五分钟振荡一次；

(4)去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清，剩余组织再消化一次；

(5)4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入种植液1重悬，培养箱内差速贴壁30min；

(6)收集上清，台盼蓝染色计数，按6×10^5cells/孔种入六孔板（种植液1），37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；

(7)培养第二天，全换液更换为种植液2；

(8)培养第四天，半量换液加入5uM的阿糖胞苷，24h全量换液；

(9)之后每周换液两次。

1d

7d

β-Tubulin Ⅲ

β-Tubulin Ⅲ