大黄酸对大鼠创伤性脑损伤的抗氧化作用与大黄相似

 背景：颅脑外伤（TBI）是世界范围内威胁生命的疾病。大多数中国人由于运动受伤，办公室或家中意外摔倒以及摩托车受伤而患有TBI。由于社会对疾病的了解不多，因此TBI被称为“沉默流行病"。 TBI后继发性脑损伤引起病理，生理和生物学反应，导致脑功能障碍。生物和化学过程通常触发连锁反应，可导致炎症细胞，能量缺乏，兴奋性毒性，细胞凋亡和氧化应激。氧化应激在上述过程中起重要作用。氧化会增强炎症和其他反应，因此促进炎症和其他反应会加剧氧化应激并形成恶性循环。氧化应激在TBI后一小时发生，并立即成为病理反应。因此，抗氧化剂策略是治疗急性TBI的关键。由于神经膜的简单过氧化作用，大脑容易受到氧化损伤。它们富含脂肪酸，容易被氧化，大脑组织需要大量的氧气。它占总耗氧量的20％。大脑富含脂质，使其更容易受到自由基的破坏。活性氧（ROS），例如超氧阴离子，羟基自由基和过氧化氢（H2O2），被认为是参与细胞生长和分化信号传递的第二信使。如果ROS的产生和去除不平衡，则会释放生物系统中的氧化应激。过量的ROS产生是在TBI发展中引起氧化应激的重要因素。细胞在有氧环境中产生过氧化氢，超氧阴离子，羟基自由基和其他活性氧。这些自由基可以与生物分子相互作用，例如DNA，碳水化合物，蛋白质，脂质，并破坏各种细胞成分。大脑富含抗氧化酶，例如过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH），可防止氧化损伤。同时，丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSSG）在脑组织中引起氧化应激。在氧化条件下，两个GSH分子提供电子并将其转换为GSSG。 GSH/GSSG摩尔比是很强的氧化应激和疾病风险指数。不幸的是，TBI的治疗效果远不能令人满意，因为其病因是由高度复杂和相互作用的机制触发的。西药的抗氧化策略失败了。科学家已经开始从中草药中寻找具有潜在创新性的植物成分，以进行抗氧化剂治疗。近年来，大黄有效地预防了由严重脑损伤引起的脑功能障碍。大黄具有抑制大鼠脑组织脂质过氧化的作用。大黄可以显着减少DNA段化，这在乳酸脱氢酶释放和细胞凋亡中起关键作用。近年来，大黄已被用于治疗脑部创伤并取得了令人满意的结果。大黄作为大黄中重要的活性成分，具有丰富的有效氧化特性。但是，TBI治疗的机制仍不清楚。因此，本研究旨在确定大黄酸的抗氧化作用，并进一步确定大黄酸是否可以用作大黄的靶向治疗材料来治疗TBI。

      方法：动物和外科手术：在标准温度22±2℃，12-12明暗循环，相对湿度50±10％的标准条件下饲养200-300g雄性SD大鼠。试验前12小时不给大鼠喂食，但给它们充足的水。将108只SD大鼠随机分为6组，每组分别在3个时间点（8、16和24小时）进行功效测试：（1）对照组：TBI后对大鼠进行灌胃通过氯化钠（n = 6）给予等量的生理盐水（0.9％）；（2）假手术组：大鼠进行了相同的手术，只是大脑皮层完整（ ＝ 6）；（3）12g/kg大黄治疗组：同一创伤大鼠口服大黄（n ＝ 6）；（4）6g/kg大黄组：同一创伤大鼠后口服大黄。 （N ＝ 6）；（5）3g/kg大黄组：在相同的外伤大黄组之后对大鼠口服大黄（n ＝ 6）；（6）12mg/kg的雨水组：在对大鼠相同的外伤后口服（n = 6）。皮层电刺激（CCI）用于建立大鼠颅脑损伤模型。用麻醉雄性SD大鼠，并用3D火焰气锤操作。此后，在颅骨右侧的中央空间侧进行手术，用手上的环戊烷打开前reg和λ之间的中心，仅损伤实验大鼠的脑表面的一侧。损坏指数的碰撞深度为5毫米，持续500毫秒，每秒6米。我们还对对照大鼠进行了开颅手术，但并未损害大鼠大脑。然后缝合伤口，将大鼠苏醒并放置在加热垫上30-60分钟以维持正常的体温。每天观察受伤的小鼠至少4个小时。

     UPLC-MS/MS检测CCI大鼠脑组织中的大黄酸：向CCI大鼠口服大黄以测量脑组织中吸收的化合物，并通过UPLC-MS/MS测定离子峰和保留时间我测量了将大黄（3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg）和大黄酸（12 mg/kg）灌胃给予CCI大鼠。胃内给药后，在第8、16和24小时处死每组大鼠。将大鼠麻醉并以400 mg/kg的剂量腹膜内注射10％水合氯醛。 30分钟后，处死动物，收集脑样本，用足够的冰冷的DD水洗涤脑组织样本，然后加入4 ml冰甲醇进行匀浆。在4°C下以3000pm离心匀浆10分钟。离心后，将混合物蒸发至干，并在37℃下用氮气回收上清液。提取液用200μL20％甲醇溶解，溶液在4°C下以15000pm离心15分钟。离心后，用0.22μm尼龙过滤器过滤上层。将5μL注入UPLC-MS/MS系统并进行分析。

      估计氧化和抗氧化状态：用考马斯亮蓝法测量超氧化物歧化酶活性：使用试剂盒测量总SOD活性。在450nm的波长下测量液体的吸光度。活性通过蛋白质的量校正，并表示为控制时间。读取450m处的吸光度，并使用以下公式计算SOD活性：[（对照值的空白值）-（样品的空白值）] /（对照值的空白值）x 2 x（总体积/体积）/蛋白质浓度。使用mg/mg蛋白表达SOD活性。

      过氧化氢酶活性的测量：根据测试试剂盒的说明书测量CAT的活性。在450m波长下测量测试溶液的吸光度。使用摩尔Mmol过氧化氢消耗/分钟/ mg来表达酶活性。

      MDA含量测定：使用试剂盒测定MDA。要确定MDA含量，请使用（TBA）方法。谷胱甘肽活性和氧化型谷胱甘肽水平的测量：活性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽均根据GSH/GSSG检测试剂盒进行操作。 10分钟后，在分光光度计上记录405m的吸光度并计算GSH/GSSG比。总GSH含量表示为μmol/ mg蛋白质。结果：抗氧化测试作用Rhubarb和Lein显着增加了CCI大鼠脑组织中的SOD水平：与假手术组相比，CCI大鼠的SOD活性明显降低。与对照组相比，在不同时间点（16小时和24小时），大黄（12 g/kg）和大黄酸（12 mg/kg）显着增加了SOD水平。与对照组相比，在大黄（6 g/kg）的不同时间点（16 h和24 h），SOD水平显着增加。与车辆组相比，雨水（12 mg/kg）在8小时内增加了SOD含量。大黄（3g/kg和6g/kg）在8小时时与载剂组相比没有统计学意义。hubarb和Rein显着增加CCI大鼠脑组织中的CAT水平：与假手术组相比，CCI大鼠中CAT活性显着降低。结果表明，大剂量大黄（12g/kg）和16h大黄酸（12mg/kg）分别在8h和16h后显着增加了CAT活性。与媒介物组相比，该线（12 mg/kg）在不同时间点（8小时和24小时）增加了CAT水平。在不同时间点（8、16、24小时），大黄（3 g/kg）与对照组相比没有统计学意义。大黄和大黄酸可以显着降低CCI大鼠脑组织的MDA含量：与假手术组相比，CCI大鼠的脑MDA含量显着增加。高剂量大黄（12g/kg）和大黄酸（12mg/kg）16和24小时后，MDA活性显着降低。与治疗组相比，大黄（6g/kg）和大黄酸（12mg/kg）可以在16小时和24小时时显着降低MDA含量（12mg/kg）。大黄（3g/kg，6g/kg）在8小时内与赋形剂组相比没有统计学意义。最大的变化发生在24小时内。hubarb和Rein显着增加CCI大鼠脑组织中的GSH含量和GSH/GSSG比。脑损伤可降低CCI大鼠的GSH含量和GSH/GSSG比，并增加GSSG。结论：线是大黄灌胃后CCI大鼠大脑中的活性成分。该产品线与大黄在创伤性脑损伤治疗中的抗氧化能力相似（通过增加SOD，CAT活性，GSH水平和GSH/GSSG比，以及降低MDA和GSSG）。

      结果表明，大黄和大黄酸可以作为神经保护剂治疗TBI。