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大黄酸对大鼠创伤性脑损伤的抗氧化作用与大黄相似

发布时间:2022-02-25      点击次数:199

 背景:颅脑外伤(TBI)是世界范围内威胁生命的疾病。大多数中国人由于运动受伤,办公室或家中意外摔倒以及摩托车受伤而患有TBI。由于社会对疾病的了解不多,因此TBI被称为“沉默流行病"。 TBI后继发性脑损伤引起病理,生理和生物学反应,导致脑功能障碍。生物和化学过程通常触发连锁反应,可导致炎症细胞,能量缺乏,兴奋性毒性,细胞凋亡和氧化应激。氧化应激在上述过程中起重要作用。氧化会增强炎症和其他反应,因此促进炎症和其他反应会加剧氧化应激并形成恶性循环。氧化应激在TBI后一小时发生,并立即成为病理反应。因此,抗氧化剂策略是治疗急性TBI的关键。由于神经膜的简单过氧化作用,大脑容易受到氧化损伤。它们富含脂肪酸,容易被氧化,大脑组织需要大量的氧气。它占总耗氧量的20%。大脑富含脂质,使其更容易受到自由基的破坏。活性氧(ROS),例如超氧阴离子,羟基自由基和过氧化氢(H2O2),被认为是参与细胞生长和分化信号传递的第二信使。如果ROS的产生和去除不平衡,则会释放生物系统中的氧化应激。过量的ROS产生是在TBI发展中引起氧化应激的重要因素。细胞在有氧环境中产生过氧化氢,超氧阴离子,羟基自由基和其他活性氧。这些自由基可以与生物分子相互作用,例如DNA,碳水化合物,蛋白质,脂质,并破坏各种细胞成分。大脑富含抗氧化酶,例如过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH),可防止氧化损伤。同时,丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSSG)在脑组织中引起氧化应激。在氧化条件下,两个GSH分子提供电子并将其转换为GSSG。 GSH/GSSG摩尔比是很强的氧化应激和疾病风险指数。不幸的是,TBI的治疗效果远不能令人满意,因为其病因是由高度复杂和相互作用的机制触发的。西药的抗氧化策略失败了。科学家已经开始从中草药中寻找具有潜在创新性的植物成分,以进行抗氧化剂治疗。近年来,大黄有效地预防了由严重脑损伤引起的脑功能障碍。大黄具有抑制大鼠脑组织脂质过氧化的作用。大黄可以显着减少DNA段化,这在乳酸脱氢酶释放和细胞凋亡中起关键作用。近年来,大黄已被用于治疗脑部创伤并取得了令人满意的结果。大黄作为大黄中重要的活性成分,具有丰富的有效氧化特性。但是,TBI治疗的机制仍不清楚。因此,本研究旨在确定大黄酸的抗氧化作用,并进一步确定大黄酸是否可以用作大黄的靶向治疗材料来治疗TBI。

      方法:动物和外科手术:在标准温度22±2℃,12-12明暗循环,相对湿度50±10%的标准条件下饲养200-300g雄性SD大鼠。试验前12小时不给大鼠喂食,但给它们充足的水。将108只SD大鼠随机分为6组,每组分别在3个时间点(8、16和24小时)进行功效测试:(1)对照组:TBI后对大鼠进行灌胃通过氯化钠(n = 6)给予等量的生理盐水(0.9%);(2)假手术组:大鼠进行了相同的手术,只是大脑皮层完整( = 6);(3)12g/kg大黄治疗组:同一创伤大鼠口服大黄(n = 6);(4)6g/kg大黄组:同一创伤大鼠后口服大黄。 (N = 6);(5)3g/kg大黄组:在相同的外伤大黄组之后对大鼠口服大黄(n = 6);(6)12mg/kg的雨水组:在对大鼠相同的外伤后口服(n = 6)。皮层电刺激(CCI)用于建立大鼠颅脑损伤模型。用麻醉雄性SD大鼠,并用3D火焰气锤操作。此后,在颅骨右侧的中央空间侧进行手术,用手上的环戊烷打开前reg和λ之间的中心,仅损伤实验大鼠的脑表面的一侧。损坏指数的碰撞深度为5毫米,持续500毫秒,每秒6米。我们还对对照大鼠进行了开颅手术,但并未损害大鼠大脑。然后缝合伤口,将大鼠苏醒并放置在加热垫上30-60分钟以维持正常的体温。每天观察受伤的小鼠至少4个小时。

     UPLC-MS/MS检测CCI大鼠脑组织中的大黄酸:向CCI大鼠口服大黄以测量脑组织中吸收的化合物,并通过UPLC-MS/MS测定离子峰和保留时间我测量了将大黄(3 g/kg,6 g/kg,12 g/kg)和大黄酸(12 mg/kg)灌胃给予CCI大鼠。胃内给药后,在第8、16和24小时处死每组大鼠。将大鼠麻醉并以400 mg/kg的剂量腹膜内注射10%水合氯醛。 30分钟后,处死动物,收集脑样本,用足够的冰冷的DD水洗涤脑组织样本,然后加入4 ml冰甲醇进行匀浆。在4°C下以3000pm离心匀浆10分钟。离心后,将混合物蒸发至干,并在37℃下用氮气回收上清液。提取液用200μL20%甲醇溶解,溶液在4°C下以15000pm离心15分钟。离心后,用0.22μm尼龙过滤器过滤上层。将5μL注入UPLC-MS/MS系统并进行分析。

      估计氧化和抗氧化状态:用考马斯亮蓝法测量超氧化物歧化酶活性:使用试剂盒测量总SOD活性。在450nm的波长下测量液体的吸光度。活性通过蛋白质的量校正,并表示为控制时间。读取450m处的吸光度,并使用以下公式计算SOD活性:[(对照值的空白值)-(样品的空白值)] /(对照值的空白值)x 2 x(总体积/体积)/蛋白质浓度。使用mg/mg蛋白表达SOD活性。

      过氧化氢酶活性的测量:根据测试试剂盒的说明书测量CAT的活性。在450m波长下测量测试溶液的吸光度。使用摩尔Mmol过氧化氢消耗/分钟/ mg来表达酶活性。

      MDA含量测定:使用试剂盒测定MDA。要确定MDA含量,请使用(TBA)方法。谷胱甘肽活性和氧化型谷胱甘肽水平的测量:活性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽均根据GSH/GSSG检测试剂盒进行操作。 10分钟后,在分光光度计上记录405m的吸光度并计算GSH/GSSG比。总GSH含量表示为μmol/ mg蛋白质。结果:抗氧化测试作用Rhubarb和Lein显着增加了CCI大鼠脑组织中的SOD水平:与假手术组相比,CCI大鼠的SOD活性明显降低。与对照组相比,在不同时间点(16小时和24小时),大黄(12 g/kg)和大黄酸(12 mg/kg)显着增加了SOD水平。与对照组相比,在大黄(6 g/kg)的不同时间点(16 h和24 h),SOD水平显着增加。与车辆组相比,雨水(12 mg/kg)在8小时内增加了SOD含量。大黄(3g/kg和6g/kg)在8小时时与载剂组相比没有统计学意义。hubarb和Rein显着增加CCI大鼠脑组织中的CAT水平:与假手术组相比,CCI大鼠中CAT活性显着降低。结果表明,大剂量大黄(12g/kg)和16h大黄酸(12mg/kg)分别在8h和16h后显着增加了CAT活性。与媒介物组相比,该线(12 mg/kg)在不同时间点(8小时和24小时)增加了CAT水平。在不同时间点(8、16、24小时),大黄(3 g/kg)与对照组相比没有统计学意义。大黄和大黄酸可以显着降低CCI大鼠脑组织的MDA含量:与假手术组相比,CCI大鼠的脑MDA含量显着增加。高剂量大黄(12g/kg)和大黄酸(12mg/kg)16和24小时后,MDA活性显着降低。与治疗组相比,大黄(6g/kg)和大黄酸(12mg/kg)可以在16小时和24小时时显着降低MDA含量(12mg/kg)。大黄(3g/kg,6g/kg)在8小时内与赋形剂组相比没有统计学意义。最大的变化发生在24小时内。hubarb和Rein显着增加CCI大鼠脑组织中的GSH含量和GSH/GSSG比。脑损伤可降低CCI大鼠的GSH含量和GSH/GSSG比,并增加GSSG。结论:线是大黄灌胃后CCI大鼠大脑中的活性成分。该产品线与大黄在创伤性脑损伤治疗中的抗氧化能力相似(通过增加SOD,CAT活性,GSH水平和GSH/GSSG比,以及降低MDA和GSSG)。

      结果表明,大黄和大黄酸可以作为神经保护剂治疗TBI。


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