MAP3K3TAL1JAM-A 通路调控髓系细胞迁移参与心肌缺血再灌注损伤

本研究揭示MAP3K3通过TAL1/JAM-A 信号通路调控髓系细胞跨内皮迁移（渗出），在心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）中发挥关键作用：MI/RI 患者和小鼠模型中，髓系细胞的 MAP3K3 表达显著上调且与损伤严重程度正相关，髓系细胞特异性敲除 Map3K3 可通过增强 TAL1 对 F11r（编码 JAM-A）的转录抑制、减少整合素内化，降低髓系细胞渗出并减轻 MI/RI；Pazopanib（MAP3K3 抑制剂）通过阻断 MAP3K3 的磷酸化活性，抑制 TAL1 泛素化降解和 JAM-A 表达，减少髓系细胞渗出，显著改善 MI/RI，为 MI/RI 及相关炎症疾病提供了新的治疗靶点。

研究临床背景

       急性心肌梗死（MI）后早期血供恢复可减少心肌细胞损失，但继发性心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）仍严重威胁心功能；髓系细胞（单核细胞、中性粒细胞）渗出是 MI/RI 炎症反应的关键步骤，通过释放促炎因子加剧心肌损伤，但该过程的上游调控通路尚未wan全明确。

核心分子

       MAP3K3：丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶，参与 MAPK、NF-κB 等通路，在炎症和心血管疾病中起作用，但在髓系细胞渗出中的功能未知。TAL1：转录因子，参与造血细胞生成，其在髓系细胞渗出中的作用未明确。JAM-A：由 F11r 编码，调控整合素内化和白细胞脱黏附，缺失可减少缺血再灌注损伤中的白细胞渗出。

研究目的

       阐明 MAP3K3 在 MI/RI 髓系细胞渗出中的作用及分子机制，评估其作为治疗靶点的潜力。

结果

临床样本：MI/RI 患者外周血单核细胞、中性粒细胞中 MAP3K3 的 mRNA 和蛋白水平显著高于对照组（P<0.05），且与 CK-MB（单核 / 中性粒细胞）、LDH（单核 / 中性粒细胞）、cTn特（单核细胞）等心脏标志物正相关（r 值范围 0.3-0.5，P<0.05）。
动物模型：小鼠 MI/RI 术后，心脏髓系细胞（CD45+Ly6G + 中性粒细胞、CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C + 单核细胞）的 MAP3K3 表达在术后 3 天达峰值，显著高于对照组（P<0.01）。

图 1 心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）期间髓系细胞中 MAP3K3 表达上调且与心脏标志物相关。

对 GSE123342 数据集的生物信息学转录组分析，发现与稳定型冠心病（CAD）患者相比，MI 患者外周血单个核细胞（PBMCs）中 MAP3K3 表达水平显著上调。在人类缺血性心肌病（ICM）左心室组织中（GSE57338 数据集），MAP3K3 表达也呈上调趋势（图 1B）。在 MI/RI 患者的中性粒细胞和单核细胞中分别验证了 MAP3K3 的上调表达（图 1C-E）。MI/RI 患者中性粒细胞和单核细胞中 MAP3K3 表达水平与血清心脏标志物 （包括 CK-MB、cTn特、LDH、pro-BNP、CRP、白细胞介素 - 6（IL-6））及血常规指标的相关性。结果显示，中性粒细胞和单核细胞中 MAP3K3 的 mRNA 表达水平与 CK-MB、LDH 呈正相关，而单核细胞中 MAP3K3 的 mRNA 表达水平还与 cTn特 呈正相关（图 1F-G）。

图 2 髓系细胞特异性 Map3k3 缺陷可减轻心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）并减少髓系细胞向心脏的浸润

构建髓系细胞特异性 Map3k3 缺陷（Map3k3CKO）小鼠，并在 Map3k3CKO 小鼠和 Map3k3fl/fl 小鼠中建立 MI/RI 模型。髓系细胞中 Map3k3 缺陷可改善心脏功能，表现为左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）升高（图 2A-B），且梗死面积缩小（图 2C-D）。对 MI/RI 组织切片进行免疫荧光染色，发现髓系细胞中 Map3k3 缺陷可减少心肌组织中髓系细胞的浸润（图 2E ）。

图 3 髓系细胞特异性 Map3k3 缺陷可减少心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）后髓系细胞从骨髓的跨内皮迁移及体内跨内皮迁移过程

为进一步阐明 Map3k3 缺陷对髓系细胞迁移的影响，我们对 MI/RI 小鼠进行流式细胞术分析。结果显示，Map3k3CKO 小鼠心脏中浸润的中性粒细胞和单核细胞比例均降低（图 3A-B ）。追溯髓系细胞的迁移路径发现，Map3k3CKO 小鼠血液中的中性粒细胞和单核细胞比例降低（图 3C-D ），而骨髓中的中性粒细胞和单核细胞比例升高（图 3E-F ）。将来自 Map3k3CKO 小鼠或 Map3k3fl/fl 小鼠骨髓的标记髓系细胞混合物注入循环系统，2.5 小时后检测腹腔和血液中两种髓系细胞群体的比例（图 3G）。所有混合物在血液中的标记比例略有差异，证实了 1:1 的混合比例且注射过程无影响。在腹腔中，无论使用何种染料标记，Map3k3CKO 小鼠的髓系细胞比例均降低。而当髓系细胞直接注入腹腔时，两种小鼠的髓系细胞比例无显著差异（图 3H）。

心功能改善：Map3k3CKO 小鼠 MI/RI 术后 3 天的 LVEF（58.2%±2.1% vs 45.3%±1.8%）和 LVFS（30.1%±1.2% vs 22.5%±1.0%）显著高于 Map3k3fl/fl 小鼠（P<0.01）。
损伤减轻：梗死面积（IR/AAR）从 Map3k3fl/fl 小鼠的 45.2%±3.1% 降至 Map3k3CKO 小鼠的 28.6%±2.5%（P<0.01），心肌细胞凋亡率（TUNEL 阳性率）降低 35%±4%（P<0.01）。
渗出抑制：Map3k3CKO 小鼠心脏中髓系细胞浸润比例降低 40%±5%（P<0.01），血液中髓系细胞比例降低 25%±3%（P<0.05），骨髓中髓系细胞比例升高 30%±4%（P<0.01），提示髓系细胞从骨髓到血液的渗出受阻。

图4 髓系细胞特异性 Map3k3 缺陷可增强 TAL1 对 F11r 的转录抑制功能

测序结果显示，Map3k3CKO 小鼠中，多种黏附相关基因（如 Itgb3、Adgre4、Itgax）表达上调，而脱黏附基因 F11r 表达下调（图 4A-B）。黏附与迁移通路的基因本体（GO）分析显示，Map3k3CKO 小鼠中黏附相关术语的基因富集度升高，迁移相关基因的富集度降低（图 4C）。KEGG通路 “细胞黏附分子"（mmu04514）的基因分析显示，Itgb3 和 Itgax 表达上调，F11r 表达下调（图 4D）。由于 F11r 的表达变化发生在 RNA 水平，我们追溯其转录因子，鉴定出四个可能参与 F11r 转录调控的候选转录因子：TAL1、PRDM1、PPARG 和 PBX1（图 4E）。在四个候选转录因子中，仅 TAL1 在 Map3k3CKO 细胞中的磷酸化水平降低，且特异性发生在 S122 和 S172 位点（图 4F）。双荧光素酶报告基因实验显示，TAL1 主要抑制 F11r 的转录（图 4G。在 MI/RI 小鼠血液的髓系细胞中观察到 MAP3K3 和 JAM-A 表达升高，而 TAL1 表达受到抑制（图 ）。在 Map3k3CKO 小鼠中，上述表达模式发生逆转（图 4I ）。体外实验中，单核细胞趋化因子 MCP-1 刺激骨髓髓系细胞后，MAP3K3 和 JAM-A 表达升高，TAL1 表达降低；而 Map3k3CKO 小鼠的细胞或经帕唑帕尼（MAP3K3 激酶抑制剂 ）处理的细胞中，TAL1 表达升高，JAM-A 表达受到抑制（图 4J）。在 293T 细胞中（图 4K），过表达 TAL1 可逆转 MAP3K3 过表达介导的 JAM-A 上调（图 4L ）；而敲低 TAL1 可逆转 Map3k3 敲除或帕唑帕尼处理介导的 JAM-A 下调（图 4M-N ）。反向实验证实，MAP3K3 通过下调其抑制性转录因子 TAL1，上调 F11r 的表达。由于帕唑帕尼与 Map3k3 敲除具有相似的作用效果，该机制可能依赖于 MAP3K3 的激酶活性。

图 5 Map3k3 缺陷通过 JAM-A 以磷酸化依赖的方式增强髓系细胞黏附并减少跨内皮迁移

与 Map3k3fl/fl 小鼠的髓系细胞相比，Map3k3CKO 小鼠的髓系细胞在整个时间进程中的迁移功能均受损（图 5A-D）。同时，与未处理或 IgG1 处理的细胞相比，经 JAM-A 抗体或帕唑帕尼处理的细胞迁移能力也降低（图 5A、E-F）。然而，在黏附实验中，Map3k3CKO 小鼠的髓系细胞黏附能力增强（图 5G-I）。

图 6 MAP3K3 通过在丝氨酸 122（Ser-122）位点磷酸化 TAL1，诱导其蛋白酶体依赖的降解

蛋白酶体抑制剂 MG132 可有效减少 MAP3K3 过表达介导的 TAL1 降解（图 6A）；而使用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白合成后发现，MAP3K3 过表达可加速 TAL1 蛋白降解，Map3k3 敲除可增加 TAL1 蛋白稳定性（图 6B-C）。这些结果表明，MAP3K3 通过诱导 TAL1 的蛋白酶体依赖降解来减少 TAL1 的表达。MAP3K3 过表达可增加泛磷酸化抗体检测到的 TAL1 磷酸化水平，并促进 TAL1 的泛素化；T90A 突变对 TAL1 的磷酸化和泛素化无显著影响，而 S172A 突变和 S122A 突变可显著降低 TAL1 的磷酸化和泛素化水平。我们进一步将 Ser-122 或 Ser-172 位点突变为谷氨酸（E）以模拟磷酸化状态，发现 Map3k3 敲除可降低 TAL1 的磷酸化和泛素化水平，而 S122E 或 S172E 突变可维持 TAL1 的泛素化水平（图 6D）。为明确 MAP3K3 对 TAL1 的直接磷酸化作用，我们进行了体外激酶实验，发现 MAP3K3 可直接磷酸化 TAL1 的 Ser-122 位点（图 6E）。S122A 突变可减少 TAL1 的降解，而 S122E 突变可加速 TAL1 的降解，且这种加速降解可被 MG132 逆转（图 6F）。使用 CHX 抑制蛋白合成后发现，S122E 突变可加速 TAL1 蛋白降解，而 S122A 突变可增加 TAL1 蛋白稳定性（图 6G-H）。Map3k3CKO 小鼠的细胞或经帕唑帕尼处理的细胞中，TAL1 的磷酸化水平降低，稳定性增加（图 6I）。在 293T 细胞系中也观察到了相同的现象（图 6J）。在 MI/RI 小鼠血液的髓系细胞中，p-TAL1（S122）的表达水平升高（图 6K）；而在 Map3k3CKO 小鼠中，该表达模式发生逆转（图 6L）。

心功能与损伤：Pazopanib 处理组小鼠的 LVEF（56.8%±2.0% vs 44.9%±1.9%）、LVFS（29.5%±1.1% vs 22.3%±1.1%）显著高于生理盐水组（P<0.01），梗死面积（IR/AAR）从 44.8%±3.0% 降至 30.2%±2.6%（P<0.01）。
渗出抑制：Pazopanib 处理后，心脏、血液中髓系细胞比例分别降低 38%±4%、23%±3%（P<0.01），骨髓中髓系细胞比例升高 28%±3%（P<0.01），与 Map3k3CKO 小鼠表型一致。

图 7 帕唑帕尼通过降低 MAP3K3 的磷酸化活性及髓系细胞从骨髓的跨内皮迁移，改善心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）

帕唑帕尼治疗可改善 MI/RI，表现为 LVEF 和 LVFS 升高（图 7A-B）、梗死面积缩小（图 7C-D）以及 TUNEL 染色显示的心肌细胞凋亡减少。对 MI/RI 小鼠的流式细胞术分析显示，帕唑帕尼治疗可减少中性粒细胞和单核细胞从骨髓向心脏（图 7E-F）和血液（图 7G-H）的迁移（图 7I-J）。

研究结论与意义

核心结论：MAP3K3 通过磷酸化 TAL1（Ser-122）促进其泛素化降解，解除对 F11r 的转录抑制，上调 JAM-A 表达，增强整合素内化，最终促进髓系细胞脱黏附和渗出，加剧 MI/RI。

临床意义：Pazopanib（低剂量、短期给药）可通过抑制 MAP3K3 活性，阻断上述通路，减少髓系细胞渗出，为 MI/RI 及其他炎症相关疾病（如脓毒症）提供了新的治疗策略。