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冰冻切片步骤
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定硬度,然后进行切片的方法,常用于临床快速病理诊断。以下是基于最新信息的冰冻切片实验步骤:
1.组织取材:应尽可能快地采取新鲜的材料,以防止组织发生死后变化。
2.组织速冻:将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内,如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,使组织迅速冰结成块。
3.组织固定:样品托上涂一层OCT包埋胶,将速冻组织置于其上,4℃冰箱预冷5-10分钟让OCT胶浸透组织。
4.切片:将冷冻的样品置于含OCT复合物的低温冷箱中,采用标准的冷冻组织切片法。切片时,低温室内温度以-15℃至-20℃为宜,温度过低组织易破碎。
5.切片后处理:切好室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定5-10分钟,烘箱干燥20分钟。PBS洗5分钟×3次。
6.染色:进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
7.免疫荧光染色:冰冻切片室温晾干15分钟,用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,室温孵育2小时或4℃过夜。第二天回收一抗,切片置于染缸内,PBS洗5分钟×3次,滴加二抗孵育,回收二抗后进行PBS洗,滴加DAPI工作液染核,室温10-20分钟后封片。
8.切片保存:做好的切片放在切片盒内,置于4℃冰箱,可保存一周左右。
在进行冰冻切片实验时,应注意组织的温度平衡、切片机的设置、载玻片的准备以及切片后的固定和染色步骤。这些步骤的优化有助于获得高质量的冰冻切片,从而提高诊断的准确性.
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