KO小鼠模型

KO小鼠模型构建方法及应用

1. 构建方法

传统同源重组技术：通过在胚胎干细胞（ES细胞）中引入目标基因的突变，并插入选择性标记基因（如抗性基因）来失活目标基因。这种方法的优点是精确度高，但构建过程较为复杂，周期较长。

基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）：利用CRISPR/Cas9系统，研究人员可以在受精卵或胚胎阶段快速实现单个或多个基因的敲除。CRISPR/Cas9技术具有操作简单、效率高、成本低等优点，已成为构建KO小鼠模型的主流方法。

显微注射法：将CRISPR/Cas9系统组分（如Cas9蛋白、gRNA）通过显微注射的方式注入小鼠受精卵的原核或细胞质中，然后将编辑后的受精卵移植到代孕母鼠体内。

电穿孔法：通过电脉冲将CRISPR/Cas9系统组分导入受精卵或胚胎细胞中，提高基因编辑的效率。

2. 基因型鉴定

PCR鉴定：利用特异性引物进行PCR扩增，可以快速鉴定KO小鼠。这种方法适用于初步筛选转基因阳性小鼠。

Southern blotting：通过限制性酶切和探针杂交来检测KO小鼠的基因整合情况和拷贝数。这种方法可以提供关于基因整合位点和拷贝数的详细信息。

3. 应用

疾病模型构建：KO小鼠模型被广泛用于模拟人类疾病的发生发展，研究基因在疾病中的生物学功能。例如，通过敲除肿瘤抑制基因Tp53，能够构建小鼠肿瘤模型，帮助研究肿瘤的发生和发展机制。

基因功能研究：通过敲除特定基因，可以研究其在细胞发育、免疫反应、代谢等方面的作用，在基因功能解析和疾病机制研究中占据重要地位。

药物筛选和验证：KO小鼠模型可用于药物筛选和验证，评估药物的疗效和安全性，帮助验证治疗靶点的有效性，促进新药的研发。

实例

Pcoke2-null小鼠模型：通过将Pcoke2基因的大部分外显子3替换为IREs-laz/新mei素抗性盒来生成Pcoke2-null胚胎。将胚胎注入C57BL/6雌性小鼠体内，后代与C57BL/6小鼠交配，产生野生型（WT）和Pcoke2-null（KO）小鼠。

ACE2基因敲除小鼠模型：多个研究团队利用传统同源重组、TALEN技术和CRISPR/Cas9技术构建了ACE2基因敲除（KO）小鼠模型。这些模型在研究ACE2的生物学功能病理机制中具有重要价值。