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人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验

发布时间:2022-05-14      点击次数:96

人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立:1)探讨肺癌远处转移和阻断其远处转移的研究;(2)模拟晚期非小细胞肺癌转移的自然发生过程;(3)在活体动物的完整器官内评估瘤细胞播散和肿瘤的生长。


实验方法原理         


将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549G418筛选获得稳定表达GFP细胞,对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK  IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。


实验材料         


BALB c nu nu裸鼠腺癌细胞株A549


试剂、试剂盒        

 

小牛血清RPMI-1640培养液pRNAT-U6 Neo磷酸钙即用型SP超敏 感免疫组化染色试剂盒DAB Kit 显色试剂盒甲醛EDTA


仪器、耗材     


荧光显微镜光学显微镜


实验步骤     

   

一、实验材料准备

 

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只,雄性,4-6周龄,体重18-20 g,无特定病原体(SPF)级饲养。

 

2.  肺腺癌细胞株A549,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)5% CO237℃培养,常规传代。

 

3.  质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司),携带Neomycin耐药基因供筛选,在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 μg/ml维持筛选。

 

二、细胞的转染

 

1.   哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司),按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞,转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。

 

2.  后培养液内加G418筛选获得稳定转染。


3.  利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后,有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。

 

4.  1月后收获转染细胞,常规传代培养,培养液中加G418(200 μg/ml)维持筛选。

 

5.  测定转染后A549细胞增殖动力学指标,对比转染前后A549细胞生长曲线,检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。

 

6.  待细胞增殖达一定数量后,裸鼠皮下注射转染前后细胞,记录成瘤时间,用公式V=1/2×长×宽 计算肿瘤体积,对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。

 

三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立

 

1.  取转染后细胞,用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5×106/0.2 ml备用。

 

2.  0.5%的麻醉50 mg/kg)(中国医药上海化学试剂公司)腹腔注射麻醉裸鼠,用26号针头吸取细胞悬液0.2 ml注射入裸鼠左侧胸腔,注射过程中注意控制刺入针头的深度。

 

3.  整个操作过程在细胞收获后半小时内完成,严格遵循无菌原则。

 

4.  注射后在KODAK IS2000MM下确认原位种植成功,注射部位为胸腔。

 

5.  注射后继续饲养,隔天观察一次并记录体重。

 

6.  当裸鼠出现精神萎靡、呼吸短促、弓背并明显消瘦,体重较注射Et减轻20%时,颈椎脱位术处死裸鼠。


7.  开胸观察,取出器官,用10%甲醛固定保存。

 

四、检查项目

 

1.  转染后细胞荧光显微镜成像转染后2448 h荧光显微镜下观察,确认转染成功。单克隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。

 

2.  活体GFP标记成像检测应用KODAK IS2000MM进行活体荧光成像,确认注射部位为胸腔,后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。

 

3.  解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经


详细解剖学检查,取出器官、固定包埋后,以4 tun厚度连续切片,切片严格编号,奇数号行HE染色,光镜观察,以初步确定转移灶。

 

4.  免疫组织化学染色

 

选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官,在HE染色确定转移灶位置的基础上,取相邻偶数号码的切片进行免疫组化检测,CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062)LRP鼠抗人单克隆抗体(ZM0335)工作液,即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复液、DAB Kit显色试剂盒(zU9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

 

五、统计学处理

 

细胞的生长活性和肿瘤体积x±s表示,数值的比较采用方差分析。HE检测结果和活体成像检测结果的比较用x2检验。采用SPSSl30软件进行统计分析。


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