激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项

激光扫描共聚焦显微镜可测定的样品种类很多．包括生物材料、组织(切片)、细胞(亚细胞)结构等。样品中荧光的来源主要有如下几种：自发荧光(autofluorescence)、荧光染色、免疫荧光、荧光蛋白、诱发荧光(induced fluorescence)及酶致荧光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分荧光素的激发和发射波长均可在仪器自带软件的染料信息库中找到。

1．观察步骤及仪器操作  根据实验要求制备样品完毕后。即可进行观察。基本步骤如下：

(1)开启仪器电源及光源：一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。

(2)设置相应的扫描方式：在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。

(3)获取图像：选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。

(4)关闭仪器：仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。

2．获取三维图像  激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT"功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。其基本步骤是：

①开启“Z-Stack"选项；

②确定光学切片的位置及层数；

③启动“Start"，获得三维图像。

3．获取时间序列图像  共聚焦显微镜的"Time-Series"功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T"功能键，即可进行实验。“Time-Series"功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。

4．注意事项及维护保养

(1)仪器周围要远离电磁辐射源；

(2)环境无震动，无强烈的空气扰动；

(3)室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白；

(4)环境清洁；

(5)控制工作温度在5～25℃。