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细胞转染技术

发布时间:2022-05-19      点击次数:138

一、细胞转染

 细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。常规转染技术可分为瞬时转染稳定转染两大类。本实验室主要是质粒转染miRcroRNA转染慢病毒转染药物转染多肽转染等。

二、miRcroRNA转染

(一)实验材料及试剂

        六孔板、CO2培养箱、EP管、酒精灯等;无血清培养基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC细胞等。

(二)实验内容

1当六孔板中MSC细胞密度达90%时,准备转染,将无血清培养基、MEM-α或DMEM取出复温并注意平衡好;

2取出细胞,将培养基换成无血清培养基,放回孵箱培养;

3取灭菌的EP管,按要求混好RNA(约100pmol/孔),每管250ul DMEM,混匀;

4另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),轻轻混匀后室温静置5min;

5将上述两个EP管混匀;

6室温静置20min,将lipofectamine 2000-质粒混合液滴到六孔板中,500ul/孔;

7将细胞放回孵箱培养,4h后换回含血清的完全培养基。

(三)注意事项

1转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和链霉素,一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素。

2如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5mL无血清培养基。

3在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。


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