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免疫沉淀实验

简要描述:免疫沉淀实验:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

  • 更新时间:2024-03-22
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详细介绍

实验流程:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4℃缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4℃以3,000 rpm 离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5min;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析,通过免疫共沉淀确定结合蛋白


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