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肿瘤细胞体外传代培养及保种

更新时间:2023-12-21      点击次数:269

. 细胞复苏与培养

将液氮或- 80℃ 保存的肿瘤细胞于 37℃ 水浴,快速溶化,用 8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液,于 1500 / 分,离心 3 分钟。 弃上清,再吸取 8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀,再 1500 / 分,离心 3 分钟,弃上清,细胞沉淀用 1.0ml 培养基混匀,备用。 另取一个 75cm2 方瓶,加入 14.0ml 培养基质,将上述制备的含 肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中,于 37℃,5%CO2 孵育箱中培养。

若此肿瘤细胞悬浮生长,大约 34 天细胞基质会变黄,5.0ml 细胞悬液可传代一个方瓶培养,可用 34 个方瓶培养,一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达 1-1.5×107 个,根据试验所需,可决定传代的次数。 若此肿瘤细胞呈贴壁生 长,经过 3-4 天,肿瘤细胞生长至 80%-95% 单层时,弃上清,用 0.5mM EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml),处理肿瘤细胞大约 3-5 分钟,用倒置显微镜观察,当 90% 的肿瘤细胞变圆时,即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到 15ml 离心管中,于 1500 / 分下,离心 3 分钟,弃上清,加少许培养基混匀,可传代 3 75cm2 方瓶扩大培养。

. 细胞冻存

将对数生长的肿瘤细胞用 1 75cm2  方瓶按上述方法收集,于 1500 /分离心 3 分钟,弃上清,用保种液( 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀,分别加入到 2-3 只保种管中,写上肿瘤细胞名称、时间、保种者姓名,放- 80℃ 保存,次日将它们转移到液氮中保存( 注: -80  下可保存细胞半年至一年,液氮可保存细 胞 5-10 年,甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌 ( 121℃,30 分钟) ,培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌,所有操作均必须遵守无菌操作技术,避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。


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