肿瘤细胞体外传代培养及保种

一. 细胞复苏与培养

将液氮或- 80℃ 保存的肿瘤细胞于 37℃ 水浴，快速溶化，用 8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液，于 1500 转/ 分，离心 3 分钟。 弃上清，再吸取 8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀，再 1500 转/ 分，离心 3 分钟，弃上清，细胞沉淀用 1.0ml 培养基混匀，备用。 另取一个 75cm2 方瓶，加入 14.0ml 培养基质，将上述制备的含 肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中，于 37℃，5%CO2 孵育箱中培养。

若此肿瘤细胞悬浮生长，大约 3－4 天细胞基质会变黄，5.0ml 细胞悬液可传代一个方瓶培养，可用 3－4 个方瓶培养，一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达 1-1.5×107 个，根据试验所需，可决定传代的次数。 若此肿瘤细胞呈贴壁生 长，经过 3-4 天，肿瘤细胞生长至 80%-95% 单层时，弃上清，用 0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml)，处理肿瘤细胞大约 3-5 分钟，用倒置显微镜观察，当 90% 的肿瘤细胞变圆时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到 15ml 离心管中，于 1500 转/ 分下，离心 3 分钟，弃上清，加少许培养基混匀，可传代 3 个 75cm2 方瓶扩大培养。

二. 细胞冻存

将对数生长的肿瘤细胞用 1 个 75cm2  方瓶按上述方法收集，于 1500 转/分离心 3 分钟，弃上清，用保种液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀，分别加入到 2-3 只保种管中，写上肿瘤细胞名称、时间、保种者姓名，放- 80℃ 保存，次日将它们转移到液氮中保存( 注： -80℃  下可保存细胞半年至一年，液氮可保存细 胞 5-10 年，甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌 ( 121℃，30 分钟) ，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌，所有操作均必须遵守无菌操作技术，避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。