细胞活性氧实验

    活性氧(reactive oxygen species , ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2 %的氧生成的，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等。
    ROS 的产生主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。

检测方法
1、化学反应法
由于活性氧具有较高的反应活性, 它们可以与许多不同的化合物发生化学反应, 由此产生各种不同的反应生成物, 根据这些反应生成物或者反应物的变化程度可以进行定量或者定性分析。通常采用的仪器分析方法有, 化学发光法 、紫外-可见吸收分光光度法 、荧光光度法 、电子自旋探针 以及选择性电极法等。化学反应法的特点是测定灵敏度高、廉价、操作简便等。但是, 化学反应法的特异性相对比较差, 一些氧化还原反应或者酶催化反应往往对测定结果的判断产生影响, 一般需要其他分析方法作为比较, 才能获得满意的结论。

2、化学发光法
化学发光测定法是仪器分析中灵敏度较高的方法之一, 已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用 。活性氧的化学发光研究也是活性氧测定法研究领域中比较活跃的分支之一, 特别是针对H2O2 测定, 有许多灵敏度高、选择性好的化学发光体系 。进年来, 笔者在H2O2 测定方面开发了一系列高灵敏度的化学发光分析法。除此之外, 目前比较成功的活性氧化学发光测定法主要有鲁米诺法(luminol)、光泽精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。
3、分光光度法
活性氧的分光光度测定, 常用的方法有细胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基还原法 和硝基四氮唑篮(nitro blue tetrazolium ,NBT)还原法 。具有氧化活性的细胞色素C 被·O-2 还原后, 形成了在波长550 nm 处有强吸收的亚铁细胞色素 , 可以用于O-2 的直接测定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被开发为SOD 的间接定量分析法 。 
但是, 活性氧的细胞色素丙还原法存在着其它还原性物质, 如HADPA 和还原性酶的干扰, 一般情况下无法直接用于O-2 的定性分析, 需要比较在SOD 的存在下, 是否还有O-2 与细胞色素丙发生反应的结果, 从而判断O-2 的生成与否。

4、荧光光度法
与化学发光一样, 荧光分光光光度法也是灵敏度高, 操作简便的分析方法之一。比较典型的例子是, 二氯荧光素(DCFH)在过氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有萤光的DCF , 可以有效地应用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)与NO-2 在酸性条件下发生反应, 形成荧光性的1-(H)-萘三氮茂环, 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作为NO 的测定方法。