克隆形成实验

简要描述：克隆形成实验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

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实验步骤

1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的细胞生长培养基中备用。

2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

3.置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。

6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟

7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%

9.平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

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