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一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤
1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次,小心倾去PBS.
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混台液, 5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液)。
4.、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 107个细胞中加入1ml抽提试剂; 5x 106个细胞中加入0.5ml抽提试剂) , 轻轻摇动5分钟。
5、用预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来,转移细胞悬浮液到离心管中,冰浴下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14 , 000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤
1、2500xg离 心10分钟沉淀悬浮的细胞,弃去上清液
2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞, 2500xg离心10分钟沉淀细胞,去上清。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 1ml抽提试剂中加入5蛋白酶抑制剂混合液, 5 μl PMSF和5 μ|磷酸酶混合液)。
4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂( 107个细胞中加入1ml抽提试剂; 5x 106个细胞中加入0.5ml抽提试剂)
5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14 , 000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤
1、组织称重,切小块放入管中。
2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混台液, 5 μl PMSF和5u|磷酸酶混合液)。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂( 250mg组织中加入1ml抽提试剂)。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆,每次匀浆间隔冰浴1分钟,至组织*裂解。
5、裂解液于预冷的离心机中14 , 000xg离心15分钟。上清液立刻转移入 新的离心管中保存待用。
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