详细介绍
BrdU荧光染色检测原理
用BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。
BrdU荧光染色实验步骤
1.细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1 d,用含0.4%FBS培养液同步化3 d,使绝大多数细胞处于G0期。
2.加入BrdU(储液:1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。
3.弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。
4.甲醇/醋酸固定10 min。
5.经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封闭。
7.甲酰胺100℃,5 min变性核酸。
8.冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。
9.按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。
注意事项
1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml双蒸水,4℃下避光保存
2.BrdU会肌体造成不可逆损伤,使用时注意安全,避免吸入BrdU粉尘。
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