细胞体外培养

简要描述：细胞体外培养:目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基(EGM-2MV)中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。

更新时间：2024-03-22
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大鼠骨髓来源的内皮祖细胞体外培养方法

SD大鼠，250g，通过颈椎脱位处死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分钟，转移到通风柜中的解剖盘中。
打开皮肤，暴露、收集股骨，无菌状态下移除附着的肌肉和组织。
并转移股骨至预冷含双抗的PBS中，洗涤三次。冰上操作。
切断股骨骨骺，使用5mlPBS，1ml注射器针头冲洗，冲洗液由棕色变成粉红色即可（股骨变白）。冲洗后，用1ml注射器吹打3-5次。
70um滤网过滤，弃去筛网。使用 15ml 离心管，先加入分离液，然后缓慢加入滤过的悬液。20℃环境下，600g 离心 25min。
离心后，离心管中液体由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
小心吸取离心管中的，环状乳白色单个核细胞层，转移到新离心管中，加入 5-10ml 洗涤液，混匀细胞。400g，离心 10min。
弃去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。 250g，离心 10min，弃去上清。再用M199完quan培养基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清、1%双抗）清洗一次，弃去上清，M199完quan培养基重悬细胞。250g，离心 10min，弃去上清。M199完quan培养基重悬细胞，计数。
按3×10⁶/孔种入纤连蛋白包被过的24孔板，每3天换一次培养基，以去除非贴壁细胞，持续诱导培养2-3周。

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