ZFNs动物模型

一、技术原理与核心机制

ZFNs 是第一代可编程基因编辑工具，通过融合 DNA 结合域（锌指蛋白）与 DNA 切割域（FokI 核酸酶）实现靶向编辑：

1. 锌指蛋白结构域：

• 由 30-34 个氨基酸重复单元构成，每个单元通过 第 12、13 位可变残基（RVDs） 识别特定碱基：

• 单个锌指识别 3 bp，串联 3-6 个可靶向 9-18 bp 序列。

2. FokI 切割域：

• 需 二聚化 才能激活切割功能 → ZFNs 需成对设计（左臂/右臂），切割位点位于两臂结合位点之间（间隔区 5-7 bp）。

3. 编辑机制：

• 双链断裂（DSB）→ 细胞启动修复路径：

• 非同源末端连接（NHEJ） ：随机插入/缺失（Indels），导致基因敲除。

• 同源定向修复（HDR） ：需外源修复模板（如 ssODN），实现点突变或基因插入。

技术突破：shou次实现哺乳动物基因组靶向编辑（2005 年），开启精准基因编辑时代 。

二、动物模型构建流程与技术优化

（一）标准化操作步骤

（二）关键技术参数优化

• 3-6 个锌指单元串联

• Golden Gate 克隆（BsaI/BsmBI） | 6 天完成构建，成功率 >80%  |
  | 表达载体 | 双启动子载体（CMV/T7），支持 mRNA 合成与蛋白表达 | 适配多物种（斑马鱼、小鼠、猪）  |
  | 递送方式 | - 受精卵显微注射 ZFNs mRNA

• 体细胞转染 + 核移植（大型动物） | mRNA 递送减少脱靶  |
  | 修复增强 | 联合 ssODN 模板 + NHEJ 抑制剂（SCR7） | HDR 效率提升 3 倍  |

三、多物种应用案例与模型优势

（一）典型物种与疾病模型

（二）不可替代性应用场景

1. 高 GC 区域编辑：

• 无 PAM 序列限制，可靶向 CRISPR/Cas9 无法编辑的区域 。

2. 低脱靶率需求：

• 治疗性编辑中脱靶率 <0.1%（CRISPR 为 1-10%）。

3. 大型动物模型：

• 猪、牛等物种中免疫原性低于 CRISPR 。