TALENs动物模型

一、TALENs技术原理与核心突破

（一）结构设计与作用机制

TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）是一种人工工程化核酸酶，由两部分构成：

1. DNA识别域（TALE蛋白）：

• 由 34个氨基酸的重复单元 组成，每个单元通过 第12、13位的可变氨基酸（RVDs） 特异性识别单个碱基：

• 识别序列长度通常为 15-20 bp，确保靶向wei一性。

2. DNA切割域（FokI核酸酶）：

• 需形成二聚体才能切割DNA，因此TALENs需成对设计（左右臂），切割位点位于两臂之间（间隔区通常为12-20 bp）。

（二）基因编辑机制

1. 双链断裂（DSB）：

• TALE结合靶序列 → FokI二聚化 → 切割DNA双链。

2. 修复路径：

• 非同源末端连接（NHEJ） ：随机插入/缺失（Indels），导致基因敲除。

• 同源定向修复（HDR） ：需提供外源修复模板，实现精准插入或点突变。

技术突破：shu次实现任意基因组位点的精准切割，且脱靶率低于早期ZFN技术。

二、TALENs动物模型构建流程

（一）标准化操作步骤

（二）关键技术优化

• 6模块串联（+63架构）

• 酶切连接（BsaI/BsmBI） | 6天内完成构建，效率提升5倍 |
  | 表达载体 | 哺乳动物双启动子载体（CMV/T7），支持细胞转染与mRNA合成 | 适配多物种应用（斑马鱼、小鼠、人iPS细胞） |
  | 活性验证 | 酵母单杂交系统或细胞报告基因检测 | 替代耗时ES细胞打靶，周期缩短至1周 |
  | 胚胎递送 | 受精卵显微注射：

• mRNA：TALENs体外转录产物

• RNP复合物：TALE-FokI蛋白复合体 | RNP减少脱靶效应，提升安全性