细胞凋亡检测技术服务

一、活性氧检测

自由基(free radicals)，是指带不成对电子的原子、分子、离子或原子团。自由基的种类很多，如以氧(O)、碳(C)、氮(N)为中心的活性基团。活性氧族(reactive oxygen species, ROS)是生物体内一些氧化反应中形成的氧自由基，常见有超氧化阴离子(O2－)，过氧化氢(H2O2)，过氧化自由基(ROO－)和氢氧自由基(OH－)等形式。自由基外层具有非配对电子，其化学性质非常活泼，它既是电子供体，又是电子受体。

活性氧是细胞线粒体氧化呼吸中产生的自由基活性的物质，参与细胞多种生理和病理形成机制。检测细胞ROS的含量，可以了解ROS在细胞一些生理和病理状态中的变化，分析药物效应和相关机制。

活性氧检测试剂盒是利用ROS荧光探针－DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可自由透过活细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

二、TUNEL

TUNEL(TdT-mediated DUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化物酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP第五二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞。由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。TUNEL细胞凋亡试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

三、Annexin/PI染色

凋亡和坏死，是常见的细胞死亡的两种方式，它们有着截然不同的特征。凋亡是细胞程序性死亡的主要表现形式，是一个主动性的生理反应机制；坏死则是细胞对严重损伤的一种被动反应和变性过程。

凋亡涉及一系列复杂的生理生化反应，终导致细胞的解体。凋亡细胞的许多改变是特征性的。

细胞与胞核固缩是凋亡早期发生的形态学变化，这些改变与细胞骨架的特异性解体有关。核固缩伴随的染色体固缩，有显著的形态学特点。碎裂的核片断可以被胞膜包裹游离出细胞外，成为凋亡小体，并被周围细胞吞噬。染色质的这些特征性变化，可以用显微镜直接观察，或用一些荧光染料染色，在荧光显微镜下观察或进行流式细胞分析。

Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。但仅Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。

Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。