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分子实验-PCR

简要描述:分子实验-PCR:普通电泳PCR实验的原理是DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同,表现为不同的迁移率而被分开。

  • 更新时间:2021-11-12
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详细介绍

  分子实验普通电泳PCR实验的原理是DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同,表现为不同的迁移率而被分开。
 
  1.试剂
 
  PCR产物,TAE电泳缓冲液,1000x溴化乙锭储存液,电泳级琼脂糖,DNA分子量标准
 
  2.实验准备
 
  配制TAE电泳缓冲液(50x储存液,pH约8.5: Tris 碱242g 57.1ml冰已酸,37.2g Na2EDTA.2H2O,dd water定容至lL),6x加样缓冲液(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液) ; 1.5ml 离心管装入铝制饭|盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。
 
  3.操作步骤
 
  (1)称取0.4g琼脂糖粉,放入三角瓶,加入50ml TAE电泳缓冲液(1x),放入微波炉中烧开( lmin)。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末,待完全熔化后停止微波炉(切不可让胶溶液溢出到微波炉中! )。
 
  (2)戴上线手套,从微波炉中取出三角瓶,置桌面上冷却致不烫手(约50-60°C)。
 
  (3)把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可,不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。(剩 下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用)。
 
  (4)在水平电泳槽中加满1xTAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm),注意正负电极的位置连接正确。
 
  (5)待胶完全凝固后( 15-20分钟),小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上,凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的侧要朝向电泳槽的负极。
 
  (6)在凝胶上选择相邻的加样孔。用10μl 的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中(如果需要时,在相邻的加样孔中加入1.5-3ul DNA分子量标准物)。
 
  加样时持移液器的手以肘部固定在桌上,用另一只手扶住这只手的手腕,以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后(不能伸得太深,以免穿破凝胶的底部)缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。
 
  (7)打开电源开关,样品将形成条蓝色的横带 向前移动 (如果发现蓝色向后移动,立即关闭电源,调换电极)。电泳将进行约30min。
 
  (8)当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时,关闭电源。取出模具和凝胶。放入凝胶成像系统中拍照。
 
 

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