详细介绍
鬼笔环肽染色实验
鬼笔环肽(Phalloidin)是一种从毒蘑菇Amanita phalloides中分离出来的多肽物质,它能够与细胞中的肌动蛋白丝(F-actin)结合,从而用于细胞骨架的染色。
鬼笔环肽与F-actin的结合是高度特异性的,不会与肌动蛋白单体(G-actin)结合,因此它是研究细胞骨架的重要工具。通过使用荧光标记的鬼笔环肽,可以在荧光
显微镜下观察细胞中微丝的分布和形态。
鬼笔环肽染色实验步骤
1.配制鬼笔环肽溶液:通常将0.1mg的鬼笔环肽溶于1ml无水甲醇中(也可以使用DMSO或无水乙醇),配成贮存液,并在-20°C避光条件下保存。
工作液的浓度通常为5μg/ml,通过将贮存液用PBS稀释20倍来制备。
2.细胞固定:使用3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定细胞20分钟,然后用PBS清洗细胞2次。
3.染色:加入5μg/ml的荧光标记鬼笔环肽,室温染色30-60分钟,然后再次用PBS清洗细胞2次。
4.细胞核染色:可以使用DAPI或Hoechst等染料对细胞核进行染色,染色时间通常为10分钟,之后再次用PBS清洗细胞2次。
5.封片:吸去多余水分后,加入荧光封片液(中性或偏碱性缓冲液加等量甘油),盖上盖玻片,准备在荧光或共聚焦显微镜下观察。
注意事项
1.鬼笔环肽的分子量小,可以轻易穿透细胞膜,因此通常不需要对细胞进行冷丙酮和Triton X-100处理。
2.鬼笔环肽具有毒性,操作时应戴手套并在通风良好的环境中进行。
3.鬼笔环肽染色可以与抗体染色结合使用,以同时观察细胞骨架和其他细胞结构。
4.避免使用含有甲醇或丙酮的固定剂,因为这些固定剂会破坏肌动蛋白的结构,影响染色效果。
应用
广泛应用于细胞生物学研究,包括细胞形态学、细胞运动、细胞分裂以及细胞与细胞之间的相互作用等领域。
通过观察F-actin的分布,研究人员可以更好地理解细胞的功能和病理过程。
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