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CRISPR/Cas9系统源于细菌适应性免疫机制，通过双RNA引导实现靶向DNA切割：
引导机制：
crRNA（CRISPR RNA）识别靶序列，tracrRNA（反式激活crRNA）激活Cas9酶，两者可融合为sgRNA（单链引导RNA）。
PAM序列（5'-NGG-3'）是Cas9切割的必要位点，位于靶基因下游。
切割模式：
Cas9的HNH结构域切割互补链，RuvC-like结构域切割非互补链，形成双链断裂（DSB）。
修复路径：
非同源末端连接（NHEJ） ：易产生插入/缺失突变（Indels），导致基因敲除。
同源定向修复（HDR） ：需提供同源修复模板（ssODN或载体），实现精准插入或点突变。
革命性突破：CRISPR/Cas9shou次实现哺乳动物细胞的高效、可编程基因编辑，且支持多靶点同步编辑。
| 步骤 | 关键操作 | 优化方案 |
|---|---|---|
| sgRNA设计 | 靶向基因外显子区，避开脱靶位点（工具：CRISPRscan） | 添加5'端G增强转录效率 |
| 编辑组件递送 | - mRNA注射：Cas9 mRNA + sgRNA（小鼠受精卵） - 蛋白注射：Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP） | RNP减少脱靶效应 |
| 同源重组增强 | 联合注射ssODN（单链寡核苷酸）及重组增效剂（如RS-1） | RS-1提升HDR效率3-5倍 |
| 胚胎移植 | C57BL/6品系受精卵 → 假孕母鼠（ICR或BALB/c） | 移植存活率>60% |
| 模型类型 | 构建方法 | 周期 | 效率 | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ修复诱导移码突变 | 3-4个月 | 80% F0代突变 | 免疫缺陷鼠（Rag2/IL2rg双敲） |
| 点突变模型 | HDR修复+ssODN模板 | 4-6个月 | 20-40% | 阿尔茨海默病（tau-V337M） |
| 条件性敲除 | 双sgRNA靶向flox区域 + Cre小鼠杂交 | 6-8个月 | 50% F1代重组 | 肺癌模型（LoxP-Kras/p53） |
| 大片段敲入 | BAC载体同源重组 + CRISPR切割 | >8个月 | 10-15% | 人类疾病基因人源化模型 |
肝癌：
同步靶向肝细胞抑癌基因 PTEN 和 P53，8周内诱发肝癌。
脑瘤：
多基因编辑（Ptch1/Trp53/Pten/Nf1）构建成神经管细胞瘤模型。
肺癌：
组织特异性模型：条件性Cas9小鼠 + AAV9递送sgRNA（靶向Kras/p53/Lkb1），实现肺组织特异性致癌。
| 疾病 | 靶基因 | 表型特征 | 研究价值 |
|---|---|---|---|
| 白化病 | 酪an酸酶（Tyr） | 毛发/视网膜色素缺失 | 基因治疗载体验证 |
| 威尔逊病 | ATP7B | 铜代谢障碍→肝损伤 | 基因修复疗法测试 |
| 血友病乙 | F9（凝xue因子Ⅸ） | 出血倾向 | 体内基因编辑疗效评估 |
阿尔茨海默病：
MAPT突变模型：CRISPR/Cas9编辑小鼠tau蛋白基因，模拟神经纤维缠结。
糖尿病：
db/db小鼠改良：CRISPR精准引入Lepr突变，缩短模型构建周期至12周。
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